技术前沿

微生物检测| Ebio Reader 3700飞行时间质谱系统在微生物检测中的应用

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种软电离生物质谱,具有操作简便、结果高准确性、检测速度快和低成本等优点,目前已成为可靠的微生物快速鉴定技术,在微生物领域有着十分广泛的应用。
 
东西分析作为国产商品化质谱仪开拓者之一,对质谱仪技术及应用的开拓从未停止脚步。并在质谱仪器研发、生产与应用方面拥有丰富的经验和技术沉淀,2017年,东西分析推出MALDI-TOF 质谱-Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统。
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Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统

Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统是东西分析仪器有限公司开发的一款以MALDI-TOF为平台的多功能生物信息阅仪。它是一款多用途多功能的生物检测平台,既可以用于临床医学检测,也可以用于非临床领域诸如食品安全,非法添加,疾控,工业微生物等检测。
 
 
原  理
 
 
每种微生物都有特有的蛋白质组成。MALDI-TOF MS正是这样一种基于蛋白质检测的微生物快速鉴定技术。其原理是利用质谱技术将蛋白质按分子量大小排列形成的特有指纹图谱,通过测定某一细菌的蛋白质组成,并将特征峰与数据库中的参考谱图对比,即可对细菌进行准确的鉴定。
 
由此可见,数据库的种类谱图等成为制约MALDI-TOF MS的重要因素。Ebio  ReaderTM 3700M拥有强大数据库,包含有4000余种微生物, 包括多种临床致病菌,能够实现菌种的实时鉴定,无需上网检索鉴定;其搭载的神经网络人工智能算法,可对基因型相近的难辨菌(大肠杆菌和志贺氏菌)进行准确区分。同时具有自建库功能,可根据用户的实际情况建立自己的特有菌种库。
 
应 用
 
 
(一)大肠埃希菌和志贺菌的鉴别

大肠埃希菌和志贺菌是具有高度传染性、危害严重的革兰阴性肠道致病菌。这两种菌在菌落形态及生物学特性方面非常相似,常规的临床鉴定方法很容易混淆,即使通过16SrRNA测序也无法准确区分。

Ebio ReaderTM 3700M利用具有深度学习分析功能的神经网络人工智能软件,可以实现对大肠埃希氏菌和志贺菌的准确区分鉴定。
 
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大肠埃希菌,福氏志贺菌和两种混合菌的指纹图谱

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人工智能算法鉴定难辨菌种




(二)菌种鉴定

菌种鉴定MALDI-TOF MS不仅可以鉴定细菌,还可以用于细菌分型,亚种识别等。

样品处理
在Eppendorf 管中加入300µl 纯净水,挑取适量(5~10mg)菌体,混匀,再加入900 µl 无水乙醇,混匀后以12000r/min 离心2min,弃去上清液,待管中残留液体彻底干燥后,加入50µl 70% 甲酸,混匀,再加入50µl 乙腈,混匀,同样以12000r/min 离心2min,吸取上清液,与等体积的基质溶液(CHCA)混合,然后涂布于96 孔样品板上,自然晾干后进样。用校准品对仪器进行质量轴校正,随后利用Ebio ReaderTM 3700M质谱仪进行样品检测。

仪器条件
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实验结果
 
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Ebio ReaderTM 3700M分析样品的质谱图

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根据所得图谱与数据库参考谱图匹配程度,软件可以计算得到分值。根据质谱仪鉴定分值,>1.7时,结果高度可信。本实验中检测的样品质谱结果得分>2.3,表示高属水平鉴定,可能的种水平鉴定。


(三)地氯雷他定口服溶液药品中洋葱伯克霍尔德氏菌

洋葱伯克霍尔德菌是一种无条件致病菌,可引发包括肺炎、败血症、心内膜炎、伤口感染、脓肿在内的多种感染,死亡率95%,被越来越多的制药企业和药监管理系统所重视。《中国药典》2020版也新增洋葱伯克霍尔德菌检查指标。
 
菌种培养

样品制备
1. 菌种阳性对照:在生物安全柜内,将洋葱伯克霍尔德氏菌冻干粉溶于胰酪大豆胨液体培养基中,在32℃的电热恒温培养箱中培养,备用。
2. 地氯雷他定口服溶液:取三个批次地氯雷他定口服溶液溶于胰酪大豆胨液体培养基中,置32℃电热恒温培养箱中培养;
3. 地氯雷他定口服溶液+菌种培养:取三个批次地氯雷他定口服溶液和已制备的菌悬液溶于胰酪大豆胨液体培养基中,置32℃热恒温培养箱中培养.

蛋白提取
量取适量的待测样品,以5000r/min 离心5 min收集沉淀物,加入300µl 纯净水,混匀,再加入900 µl 无水乙醇,混匀后以12000r/min 离心2min,弃去上清液,待管中残留液体彻底干燥后,加入50µl 70% 甲酸,混匀,再加入50µl 乙腈,混匀,以12000r/min 离心2min,吸取上清液。

点样
移取经上述方法处理后的上清液,与等体积的基质溶液(CHCA)混合,然后涂布于96 孔样品板上,自然晾干后上仪器分析。

仪器条件
质谱仪器参数如下:正离子模式,检测范围:2000 Da~15000 Da;激光点击数:每图谱 200;激光频率:20 Hz;离子源加速电压:20 kV。每次实验前用校准品对仪器进行质量轴校正。

结果

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洋葱伯克霍尔德氏菌的质谱图

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地氯雷他定口服溶液的质谱图

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地氯雷他定口服溶液+菌的质谱图
 
从口服液质谱图和口服液+菌质谱图对比可知,地氯雷他定口服溶液中不含洋葱伯克霍尔德氏菌。


(四)食源性致病菌检测

一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌,常见且危害较为严重的食源性致病菌有鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌等。基于Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统,东西分析可提供食源性致病菌高通量、高自动化解决方案,为食源性疾病诊断提供有价值的检测结果。
 
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伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌质谱图


结 论

MALDI-TOF MS是一种非常有前景的微生物鉴定方法,它具有很明显的优势,尤其在临床使用中,常规微生物鉴定需要经过较长时间的培养,而且过程比较繁琐,费用较为昂贵。但是MALDI-TOF MS短的可以几秒出结果,而且成本较低,可以更多的惠及患者。

 
 

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