技术前沿

食品化学分析中HPLC方法与应用进展

自HPLC仪问世以来,其硬件技术、分析方法及应用研究发展迅速。本文仅就在食品化学分析中,HPLC分析技术与应用进展概述如下。
一、HPLC分析方法进展
● 液-固色谱法(LSC) LSC是根据组分基团对吸附剂表面亲和力的大小,决定了其保留程度。在LSC色谱中应用最广泛的极性固定相是硅胶。
● 反相色谱法(RPC) RPC是指在非极性固定相上的液相色谱法,固定相多为化学键合相。其代表为ODS。目前,某些极性键合相,如氨基键合相也广泛应用于反相色谱中。反相色谱可分离离子型和非离子型化合物。据统计,在食品化学HPLC分析中,90%以上的分析过程都是反相色谱法。
● 离子对色谱(IPC) IPC又称为离子对分配色谱,是近年来发展较快的一种色谱技术。目的是应用液-液分配色谱实现对强电解质和弱电解质混合物,或对电解质和非电离物质混合物的分离。IPC根据固定相和流动相的相对极性分为正相和反相方式,但反相IPC应用较多,如氨基酸、多肽、核酸、各种药物、有机酸的分析。
● 离子色谱法(IC) IC法是HPLC中用于分离分析离子型化合物的方法,按分离机理的不同,IC可分为高效离子交换色谱法(HPIC)、高效离子排斥色谱法(HPICE)和流动相离子色谱法(MPIC)。HPIC主要用于亲水阴、阳离子和碳水化合物的分离;HPICE多用于无机弱酸、有机酸、氨基酸、醛、醇的分离;MPIC可用于疏水性阴、阳离子和过渡金属配合物的分离。IC分析多种阴离子快速、灵敏、选择性好。目前许多国家建立了采用IC法测定水质中阴、阳离子的标准检验法;AOAC已批准四项用于食品分析的IC法。
● 反相胶束色谱法(RPMC) 在反相离子对色谱中,当反离子采用表面活性剂超过一般离子对色谱所用的浓度时(达0.02~0.2mol/L),此时的反相色谱称为RPMC。RPMC分为正反相胶束色谱。特点是具有高度的选择性,有利于梯度洗脱,提高了检测灵敏度。主要应用于血清、尿液中药物浓度测定,其优点是样品可直接进样分析,分析时间短,样液量少,准确度高。
● 空间排阻色谱法(SEC) 又称为体系排阻色谱法,是利用多孔凝胶固定相,依据分子大小差异来进行分离的方法。根据凝胶性质可分为凝胶过滤色谱法(GFC)和凝胶渗透色谱法(GPC)。SEC适用于需很快提供未知样品分子大小、组成、近似分子量信息。GFC适用于分析水溶液中多肽、蛋白质、核苷酸、多糖等;GPC主要用于高聚物的分子测定。如聚乙烯、聚氯乙烯等精细化工原料。
● 间接光度液相色谱法 间接光度液相色谱检测技术是一项正在发展中的色谱技术,在离子和离子对色谱中都有应用。该法是对于无紫外吸收的样品采用UVD来检测的方法。优点是扩大UVD的应用范围,可用于低响应或无响应的样品。多用于无机和有机阴离子的测定。。
● 化学衍生液相色谱法 它是采用衍生试剂,借助化学反应给样品组分化合物分子接上某个特殊基团,使其衍生物能够改善分离效果和提高检测灵敏度的方法。可分为柱前和柱后衍生法。衍生试剂有多种,可与胺类、氨基酸、酚、醇等发生衍生化反应。
二、HPLC检测器应用进展
(一) 检测器与应用进展
● 激光诱导荧光检测器(LIF) LIF与普通荧光检测器的主要区别是其以激光器做为光源。因此,其单色性好,谱带宽度可达10-8nm以下,使溶剂的瑞利散射光和拉曼散射光的带宽为1.0nm,因而可选择地消除对荧光性号的干扰;聚光性好,聚光点直径几微米,可减小流通池体积,适用于微型和毛细管液相色谱;具有最高的灵敏度(10-9mol/L~10-12 mol/L),对一些荧光效率高的物质可达到单分子检测。
● 电化学检测器(ECD) ECD是根据物质的电还原性和电氧化性来进行检测的,应用于对紫外光没有吸收或不能发出荧光,但具有电活性的物质测定。若结合衍生技术,也可应用于非电活性物质的检测。安培检测器和电导检测器在生化、医学、食品和环境分析中获得广泛的应用。
● 光电二极管阵列检测器(DAD) DAD的发展是HPLC技术最重要的进步。DAD在全部紫外波长上检测色谱信号。因此,不仅可以进行定量检测,而且可以提供组分的光谱定性信息。DAD在1s内,可快速扫描100000个检测数据,绘制出时间-吸光度-波长三维关系的立体色谱图。噪声低至3×10-6AU。目前,DAD已广泛应用于食品卫生化学检测、药物学、毒物学、临床医学、生命科学、环境科学、石油化工和高分子化工领域。
● 蒸发激光散射检测器(ELSD) ELSD有望成为像FID那样的通用型检测器。它可以对各种物质均有响应,且响应因子基本一致,其检测不依赖于样品分子的官能团,同时可以进行梯度洗脱。同RID和UVD比较,它消除了溶剂的干扰和因温度变化引起的基线漂移,灵敏度高。对于像磷脂、皂苷、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或吸收很小的化合物UVD无法进行检测,而ELSD对这些组分均有响应。ELSD没有流动相和杂质的紫外吸收干扰,提高了检测灵敏度和色谱峰的分辨率,ELSD测定无需定量校正因子,对所有组分的响应几乎一致。ELSD在食品分析中可应用于油酯类、糖、低聚糖、保健食品和保健药品等分析。
(二) 检测器联用技术
● 近年来检测器联用技术在食品化学分析中应用越来越普遍。L-M联用它既发挥了液相色谱柱对复杂化合物的分离能力,又体现了质谱的选择性、灵敏度、提供了组分分子量及结构信息。已广泛应用于氨基酸、抗生素、甾族化合物、食品污染物分析。HPLC-FTIR联机,已应用于药物与其代谢物,肽类、蛋白质分子量、分子结构等分析。HPLC-NMR联机,也应用于食品中糖类 (酒、果汁)、水质污染物、保健食品等分析。HPLC-AAS应用于磷化物,Si、Sn、Pb、As、S化合物的分离和测定;HPLC-AES适用于在线监测柱流出物中多种金属离子。HPLC-ICPAES是八十年代以后发展起来的联机技术,对许多金属离子的检测灵敏度达10-9g/mL~10-10g/mL,应用于生物样品中As、蛋白质、核糖核酸、Se等的测定。
● 近年来,随着微型柱(0.1㎜~0.5㎜id),微孔柱(0.5㎜~1㎜id)和毛细管液相色谱柱(0.05㎜~0.1㎜id)的发展,促进了液相色谱小型化。人们实现了将GC的通用检测器FID以及其他一些检测器与HPLC在线连接。HPLC-FID(TID、NPD、FPD、PID、ECD、TEA)。
三、HPLC法在食品分析中应用进展
(一) 食品添加剂
       食品添加剂分析多采用RHPLC、IPC、HPICE;检测器应用最多的是紫外-可见光检测器(UVD),其次是电导检测器(CD)和折光示差检测器(RID)或采用UVD-RID,UVD-CD检测器的串联技术;色谱柱主要是C18柱,其次是阴离子色谱柱。同时,多种食品添加剂组分同时检测技术倍受关注。
● 甜味剂 HPLC法可以测定食品中糖精钠、甜味素、甜蜜素、安赛蜜、甘草苷、甜菊苷等多种甜味剂,其测定人工合成甜味剂最常用的方法为RHPLC-UVD法、阴离子交换色谱法、离子对色谱法。因此,常用检测器有UVD、CD;色谱柱为C18柱、阴离子交换柱和-NH2柱。
● 防腐剂 HPLC法测定防腐剂方法简便,灵敏,准确。其中,BA、CA、对羟基苯甲酸乙酯(丙酯)、脱氢乙酸均可采用RHPLC测定。UVD-RID串联可同时检测甜蜜素、BA和CA。
● 有机酸 采用UVD或RID检测器,C18柱的RHPLC法可同时测定食品中乳酸、酒石酸、苹果酸、醋酸、柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸;或采用PICE法,电导检测器可以测定葡萄酒、酱油、酸奶、啤酒中柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸、乙酸、乳酸、乙酰丙酸、焦谷氨酸。
● 色素 HPLC可同时测定多种人工合成色素和天然色素。方法简便。如采用HPLC-UVD,C18柱分离的梯度洗脱系统可同时测定新红、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、赤藓红、亮蓝。
● 增白剂 RHPLC测定过氧化苯甲酰的最低检测浓度为0.04mg/kg。IC法可测定各类食品中H2SO3。AOAC990.31规定饮料中的亚硫酸盐利用磺化聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂柱的PICE进行分离,安培检测器检测。若以阴离子柱分离,CD检测食品中H2SO3,最低检测量0.2μg。
● 抗氧化剂 用RHPLC的梯度洗脱方式,可同时测定油脂中九种抗氧化剂。其最低检测浓度为2mg/kg,或以HPLC法同时分离PG、BHT、BHA,方法回收率分别为95.0%;99.0%;84.0%。
● 咖啡因 采用C18反相体系UVD可同时检测饮料中安赛蜜、糖精钠、咖啡因和甜味素,前三者最低检测浓度各为0.004mg/mL或单独测定饮料中咖啡因。
(二) 营养成分
● 氨基酸 采用RHPLC、IC法和氨基酸自动分析仪结合衍生技术可以测定食品中多种氨基酸,检测器有UVD和FD。常用衍生剂有PTTC、FMOC、AQC。
● 脂肪酸 目前,采用RHPLC法,以专用脂肪酸分离柱,实现了脂肪酸的快速分离。可以采用RID或UVD检测器。前者灵敏度低,后者需将无紫外吸收的脂肪酸衍生化,提高检测灵敏度。采用C18柱UVD检测了鱼油等油脂中硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。
● 碳水化合物 采用RID,氰基柱、氨基柱和C18柱可检测食品中多种糖类。AOAC995.13规定,利用非金属液相色谱系统,采用季胺盐、乳胶微珠附聚的二聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂柱,以脉冲安培检测器可检测即溶咖啡中游离碳水化合物和总碳水化合物(果糖除外);以氨基柱或C18柱分离,RID检测果低聚糖浆和大豆等食品中果糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖、低聚糖等糖类。
● 维生素 目前,多采用UVD(FD)、C18柱的RHPLC测定食品中VA、VD、VE、VK、VC、叶酸、烟酰胺、泛酸。FD对维生素的检测应用少于UVD;采用IPC对多组分维生素的测定研究取得较大进展。加入庚烷磺离子对试剂,IPC可同时测定VB1、B2、B5、叶酸。以UVD,C18柱可同时测定VB1、咖啡因、烟酸、VB6、烟酰胺。VA具有强荧光性,因此采用FD比UVD灵敏度高。但当VA含量较高时,也可采用UVD检测。泛酸测定可以采用FD或UVD。但当组分预先经C8柱分离,经衍生化生成荧光物质,其灵敏度比UVD提高10~100倍。
(三) 营养强化食品
       营养强化食品中维生素HPLC测定进展见食品营养成分分析。
(四) 保健食品
       保健食品功能性成分分析是近年来食品化学研究的热门课题之一。研究表明,多数保健食品的功能性成分都可以采用RHPLC(UVD,C18柱)进行分析。如苷荟苷、DHEA、脱氢表雄酮、异嗪皮定、冬虫夏草中的腺苷、松果体素、红景天苷、儿茶素、酚酸化合物、人参皂甙等。采用凝胶排斥色谱柱,以RID测定香菇多糖,方法简便,快速准确。有机锗(Ge-132)的生理药物活性倍受关注,以HPICB-AS1柱,采用CD-柱后反应系统-UVD依次串联,电导法测定Ge-132和Ge+4。抗生物氧化保健食品功能成分也多采用RHPLC系统检测,如类胡萝卜素、β-胡萝卜素、芦丁、银杏叶黄酮醇糖甙、银杏内酯A、B、C、白果内酯;齐墩果酸和熊果酸。牛磺酸测定采用HPLC的衍生化法;离子交换色谱法测定新鲜食品中核苷酸(5‘IMP、5'GMP、5‘AMP、次黄漂呤)。
(五) 食品污染物
1)农药残留量分析
● 有机氯和有机磷农药 采用正相液相色谱法,可检测食品中有机氯农药(艾氏剂、DDT、狄氏剂、DDD和甲氧DDT)。对某些热不稳定的有机磷农药,HPLC法检测起到更重要的作用。RHPLC法可以同时测定多种有机磷农药,如敌百虫、乙基对氧磷、马拉硫磷、杀硫磷和乙基对硫磷。RHPLC-UVD,C18柱,可测定乙基谷硫磷、谷硫磷、杀螟硫磷、乙基硝苯硫磷酯、对氧磷、硝基苯硫磷酯和西维因,回收率达75~90%。辛.硫丹是有机氯和有机磷农药(辛硫磷)复合而成的高效杀虫剂,HPLC法分离快速、测定准确。
● 氨基甲酸酯类农药 HPLC法对该类农药分离效果好,分析时间短,精密度和准确度高,是分析氨基甲酸酯类农药的理想方法。HPLC测定该类农药多采用RHPLC法,以UVD、FD、电化学检测器一次可以分离测定食品中多种氨基甲酸酯类农药。利用电化学安培检测器检测氨基甲酸酯农药,不用进行衍生化反应,并且提高了灵敏度,是很有前途的检验法。UVD检测该类农药的灵敏度低于FD;GB/T5009.21-2003RHPLC法检测粮油、蔬菜中甲萘威最低检测浓度为0.5mg/kg。目前,HPLC法同时测定氨基甲酸酯农药和杀菌剂的研究取得重要进展,如采用C18柱和UVD可编程检测器测定了水果中多种氨基甲酸酯杀虫剂和取代苯类杀菌剂,方法灵敏度高。
● 拟除虫菊酯类农药 采用正相或反相液相色谱法均可测定拟除虫菊酯类农药。以RHPLC法检测了水稻、蔬菜、水果中六种拟除虫菊酯农药;用HPLC-UVD的正相色谱法测定水果蔬菜中氯氰菊酯的回收率为99.9~101.4%,RSD1.79%;HPLC法可同时测定甲基对硫磷和氯氰菊酯。
● 除草剂 HPLC是分析苯脲类、苯氧基烷酸类、三嗪农类除草剂比较理想的分析方法。据报道,采用RHPLC-UVD法可分别测定用谷粒、土壤中的绿溴隆等七种除草剂,以及牛肉中敌草隆、绿麦隆和大米、谷物中氟磺胺草醚。HPLC-UVD和HPLC-MS测定三嗪农农药报道很多。在食品中的分析应用可参考其方法。苯氧基烷酸除草剂(PAAS)传统的分析方法以GLC为基础,但必须先进行衍生化反应,采用HPLC(UVD、C18柱)法可测定9种PAAS。
● 杀菌剂 采用HPLC-UVD或FD均可测定水果、蔬菜、花生中甲基统扑净、苯菌灵、多菌灵、百菌清。但HPLC-FD的灵敏度比HPLC-UVD高一个数量级。HPLC法简单、准确。
● 食品中亚乙基硫脲(ETU)是杀菌剂代森钠(锰、锌)等的降解产物。其高浓度时具有三致作用。采用HPLC-UVD正相色谱系统可以测定葡萄酒、啤酒、水果中ETU。
● 单甲脒 单甲脒为高效杀螨杀虫剂。采用RHPLC(UVD、C18柱)分离检测柑橘、苹果中单甲脒,最低检测量2ng,最低检测浓度0.025mg/kg,线性范围0.2~100μg/mL。
2) 食品中抗生素类药物残留量分析
● HPLC法是目前对食品中抗生素分离和残留量测定最理想的方法。灵敏度高、准确、快速。特别是HPLC-DAD和HPLC-MS的应用,提高了灵敏度和可靠性。常用检测器有UVD、FD、DVD、MS,其灵敏度依次为HPLC-MS、HPLC-FD、HPLC-UVD;色谱分离柱多为C18柱及氰基柱。HPLC法可以检测食品中的抗生素有:
● 四环素族抗生素(PENS) 四环素、土霉素、金霉素。
● 青霉素族抗生素 苄青霉素、苯氧甲基青霉素、甲氧苯青霉素、乙氧苯青霉素、羟氨基苄青霉素、邻氯青霉素、氨苄青霉素等。
● 氨基糖苷类抗生素(AGS) 链霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素和壮观霉素。该类抗生素没有紫外发色团和荧光团,所以常采用HPLC的柱前或柱后衍生法进行测定。。
● 氯霉素(CAPS) 氯霉素、间硝基氯霉素、琥泊氯霉素、棕榈氯霉素、乙酰氯霉素、甲砜氯霉素、氟甲砜氯霉素。许多国家已禁止在动物性食品中使用。
● 氟喹诺酮类(FQS)抗生素 诺氟沙星、双氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、单诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、沙保沙星等。色谱柱几乎均为C18柱,检测器有UVD、FD、MS。其检测灵敏度HPLC-MS依次大于HPLC-FD和HPLC-UVD。
● 大环内酯类抗生素(MALS) 泰乐菌素、螺旋霉素、替米沙星、北里霉素、交沙霉素、美罗沙霉素、塞地卡霉素和红霉素。HPLC法测定MALS检测器有UVD和MS。其中,HPLC-MS可以同时测定多种MALS,色谱柱多为C18柱。HPLC-MS法具有更高的灵敏度,
● 动物性食品中磺胺类(SAS)药物 磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、氨基嘧啶、磺胺脒。SAS测定主要采用RHPLC法,其具有很高的灵敏度和准确性。
● 食品和饲料中硝基呋喃的药物 呋喃唑酮(痢特灵)、呋喃西林、呋喃妥因。RHPLC广泛应用于痢特灵残留量分析。
● 内脏、饲料中苯乙胺类(PEAS)药物 克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、塞曼特罗、塞布特罗、马贲特罗、雷拖帕明、沙丁胺醇、特布他林。其中主要是克伦特罗,FDA将克伦特罗规定为肉类食品必检项目。其分离检测多采用HPLC-DVD,C18柱,灵敏度高、结果准确。同时,农业部建立了测定饲料中克伦特罗的行业标准,采用RHPLC法, UVD或DAD检测器,C18柱。...
● 食品中抗寄生虫类药物残留量HPLC法测定
● 食品中抗寄生虫类药物残留量多采用RHPLC法。检测器有UVD、FD、MS。HPLC-MS法灵敏度最高,采用RHPLC的柱后衍生法测定可进一步提高灵敏度。如伊维菌素、莫能菌素、盐霉素,苯并咪唑类(BZs):塞苯咪唑、硫氧咪唑、甲苯咪唑、丙硫咪唑(A、B)和硫苯咪唑;氯羟吡啶、尼卡巴嗪、乙氧酰胺苯甲酯。
3) 动物性食品中性激素残留量的HPLC法测定
    性激素包括 甾类激素和非甾类激素。前者有雄激素(去氢睾酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙等)和雌激素(孕酮、炔诺酮、甲炔诺酮);后者包括乙烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚等。
激素在动物性食品中残留量甚微,用一般的分析方法很难检测,而且底质干扰严重。目前,雌激素残留量测定多采用UVD和DAD的RHPLC法、反相离子对色谱法、阴离子交换色谱法。DAD的应用提高了方法的灵敏度和准确度。雄激素测定多采用正相HPLC法。以2,4-二硝基苯肼做衍生剂,可以检测各种肉及其制品中睾酮、甲基睾酮、去氢甲睾酮。
4) 食品中霉菌毒素的HPLC法测定
    RHPLC法可以检测食品中多种霉菌毒素。如展青霉素、烟曲霉震颤素B(FTB)、黄曲霉毒素(AFT B1、B2、M1、M2、G1、G2),赭曲霉毒素。前两者采用UVD,后两者采用FD检测。用TFA衍生化,以FD(Ex245nm,Em360nm)可提高AFT B1 M1 G1检测灵敏度,
5) 食品中多环芳烃(PHA)和多氯联苯PCB化合物的HPLC法测定
    采用RHPLC(UVD,C18),可以测定食品中苯并(j)芘等9种PHA,其最低检测浓度为0.16~1.0μg/kg;而采用RHPLC-FD,C18柱,可进一步提高分离测定B(a)P、苯并(k)荧蒽、苯并(b)荧蒽的灵敏度。样品用碱液破坏有机氯农药后再用水蒸气蒸馏出PCBS,经提取,净化、浓缩,以μ Bondepak Pheny柱, ACN+H2O(75+25)为流动相,UVD检测PCBS。
6)食品和包装材料中毒性化合物的HPLC法测定
● 棉酚 采用RHPLC-UVD,C18柱,测定棉籽油中棉酚,其最低检测量为20ng;
● 亚硝胺类化合物 正相和反相高效液相色谱法均可测定啤酒、腌、熏肉、火腿、豆制品和奶等食品中亚硝胺类化合物。采用HPLC-UVD,氰基柱,可检测衍生物形式亚硝胺;而采用HPLC-UVD,C18柱,测定食品中亚硝胺类化合物。啤酒中二甲基亚硝胺可以以亚硝胺和衍生物两种形式测定。
● 甲醛 水发食品中甲醛HPLC法 以RHPLC(UVD,C18柱),结合2,4—二硝基苯肼柱前衍生,测定水发食品中甲醛,最低检测浓度0.05mg/L。
● 罂粟壳成分 采用HPLC-UVD(254nm,C18柱)测定汤汁、卤料等中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁,以梯度洗脱技术分离效果较好。
● 组胺 采用HPLC-FD,C18柱衍生化法测定鱼体中六种组胺:腐胺、酪胺、尸胺、组胺、精胺、亚精胺,回收率96~98.8%。
● 己内酰胺 采用HPLC(UVD,C18柱)流动相ACN+H2O(11+89),测定复合包装袋中己内酰胺,最低检测浓度0.2mg/kg,最低检测量2ng。
四、结论
● 食品化学分析中,HPLC法是最常用的理想检验法,绝大多数食品化学成分都可以用HPLC法测定。近年来,诸多液相色谱法在食品化学分析中的应用范围逐渐增大,如RHPLC、IC、SEC、HPICE、衍生化色谱法、间接光度液相色谱法,其中,RHPLC法应用最为广泛。
● 食品化学分析中,各种新问世的检测器应用范围逐步增大,如电化学检测器、DAD、ELSD。同时,单柱双检测器的联用技术以及同其他仪器检测器的联用技术都开始应用于食品化学分析。
● 在RHPLC中,UVD和C18分析柱的使用率高于分析项目的90%。
● HPLC法在食品化学分析中,几乎适用于各类检测项目,且应用范围也逐渐增大。包括食品添加剂、食品营养成分、食品污染物、保健食品和营养强化食品。因此,HPLC仪是食品工业、食品卫生检测与监督等实验室不可缺少的分析仪器。

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作者:袁彦华 

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